如何進(jìn)行細(xì)胞染色
I.細(xì)胞的染色例
1. 染色例1
以染色HeLa細(xì)胞為例,介紹使用如下試劑的方法
1). 試劑溶液的配制
配制以下的儲備液
Calcein-AM 0.5 mg/ml DMSO solution
BCECF-AM 1 mmol/l DMSO solution
CFSE 1 mg/ml DMSO solution
CytoRed 1 mmol/l DMSO solution
FDA 0.5 mg/ml DMSO solution
PI 1 mg/ml H2O solution
EB 1 mg/ml H2O solution
DAPI 1 mg/ml H2O solution
AO 1 mg/ml H2O solution
* DMSO solution在
2). 器具
蓋玻片 18 mm × 18 mm
培養(yǎng)皿 (直徑約35 mm)
鑷子
3). 操作
1) 用5.0 ml PBS(-)溶解10 μl儲備液,配制成染色液。
*由于用DMSO溶解的儲備液在水溶液中易分解,所以染
色液要現(xiàn)配現(xiàn)用,放置長時間后不能染色。
2) HeLa細(xì)胞用Trypsin-EDTA制成細(xì)胞懸液。
3) 將細(xì)胞懸液離心分離(速度: 1,000 rpm,時間: 3分鐘)。
4) 去除上清液,加入PBS(-),控制細(xì)胞數(shù)量在105-106 個/ml。
5) 用移液槍吹打充分。
6) 在1.5ml微管中加入30 μl第4) 步得到的細(xì)胞懸液。
7) 加入15 μl染色液。
8) 蓋上蓋子,在
9) 取10 μl第8) 步的染色溶液滴加在蓋玻片上, 上面再覆蓋
另一張蓋玻片。
10) 將蓋玻片放在熒光顯微鏡下,用染色試劑對應(yīng)的激發(fā)波
長觀察。
2. 染色例2
以MitoRed染色細(xì)胞為例,介紹使用如下試劑的方法
1).試劑溶液的配制
配制以下的儲備液
MitoRed 1 mmol/l DMSO solution
(用78 μl DMSO溶解1支50 μg的MitoRed)
*DMSO solution在
2). 操作
1) 用培養(yǎng)基稀釋1 mmol/l 儲備液。MitoRed終濃度為:20-
200 nmol/l
*加入到細(xì)胞前,推薦先在
2) 在細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)細(xì)胞 (細(xì)胞濃度:1×105- 1×106個
/ml)。
3) 去除培養(yǎng)基,用 (培養(yǎng)基:PBS,Hank,s溶液等)輕輕
地清洗。
4) 將稀釋的試劑溶液添加至每孔,在培養(yǎng)條件下,培養(yǎng)
30-60分鐘。
5) 去除含色素溶液的培養(yǎng)基,添加新的培養(yǎng)基。
6) 用熒光顯微鏡觀察。
固定細(xì)胞的時候,在第4) 步的操作后按以下步驟操作。
5) 去除MitoRed溶液,用不含血清的培養(yǎng)基, PBS,
Hank,s溶液清洗。
6) 用10%中性 福爾馬林緩沖液,固定15-20分鐘。
7) 用PBS清洗。
8) 用熒光顯微鏡觀察。
圖P-7-1 j) 染色HeLa細(xì)胞的熒光圖像。
3. 染色例3
介紹以Hochest 33258,33342染色細(xì)胞為例
1). 試劑溶液的配制
配制以下的儲備液
Hochest 33258 1 mg/ml H2O solution
Hochest 33342 1 mg/ml H2O solution
細(xì)胞固定液:1%戊二醛/PBS(-)
培養(yǎng)液:PBS(-)
2). 操作
1) 將含約1×106個細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基離心5分鐘
(速度:400 x ),去除上清液。
2) 加入100 μl細(xì)胞固定液,采用吹打等方法,充分混合。
3) 在室溫下靜置30分鐘。
4) 離心5分鐘 (速度:400 x ),去除上清液。加入1 ml
PBS(-)混合后,再離心5分鐘 (速度:400 x )。
*此操作為了充分清洗掉戊二醛,如果存在戊二醛,會導(dǎo)致淬滅。
5) 加入20 μl PBS (-),混合后加入4 μl熒光色素,再混合。
6) 滴1滴細(xì)胞染色液在載玻片上,將蓋玻片蓋在上面。
7) 用熒光顯微鏡觀察。
圖P-7-1 k)、I)染色正常人胎兒細(xì)胞的熒光圖像。